各種アポトーシスアッセイ

アポトーシスの信頼性の高い検出と測定は、アポトーシス関連疾患の治療法の開発およびアポトーシス機構全般の研究に不可欠であり、多くの方法が開発されています。 アポトーシスの検出における主要な問題の1つは、アポトーシスと壊死のプロセスの多くの特徴が重複するため、最終的な結論を出す前にいくつかの独立したアッセイを使用する必要があることです。 各メソッドには利点と制限があり、一部のアプリケーションには適しているものも他のアプリケーションには適していない場合があります。 NucleoCounter NC-3000™システムは以下のアポトーシスアッセイに対応しております。


◆DNA断片化
◆カスパーゼアッセイ
◆アネキシンVアッセイ
◆ミトコンドリア膜電位アッセイ

DNA断片化

NC-3000™を使用した後期アポトーシス評価のためのDNA断片化の検出

概要

アポトーシスが起こっている間、カルシウム依存性およびマグネシウム依存性のヌクレアーゼが活性化され、DNAを分解します。 これは、DNA内に断片化を引き起こすニックと二本鎖切断があることを意味します。 このアポトーシスの後期事象は、DNA含有量解析を使用して検出され、1DNA等量より少ない細胞(いわゆるsub-G1細胞)を測定します。

原理

NucleoCounter®NC-3000™システムは、蛍光顕微鏡と画像分析を使用して、断片化されたDNAを持つ細胞(サブG1細胞)の検出を自動化します。 固定細胞のDAPI染色後、サンプルはNucleoCounter®NC-3000™システムを使用して分析され、細胞蛍光が定量化され、断片化されたDNAを持つアポトーシス細胞は、PC画面に表示されるDNA含有量ヒストグラムのサブG1ピークとして見られます。ヒストグラムのマーカーを使用して、アポトーシス細胞を区別できます。結果はPlotManagerで表示されます。

図:Jurkat細胞をカンプトテシンの非存在下(上列)または存在下(下列)で増殖させ、DNAフラグメンテーションアッセイとNucleoCounter®NC-3000™を使用して細胞を分析しました。 散布図とヒストグラムは、NucleoView™NC-3000™ソフトウェアから取得しました。 表示されたヒストグラムのマーカーを使用して、断片化されたDNAを持つセル(Sub-G1セル)を区別しました。 色付きのヒストグラムは、未処理(青線)とカンプトテシン処理(赤線)のサンプルのマージです。

操作手順

消耗品

カスパーゼアッセイ

FLICAカスパーゼアッセイを使用したアクティブカスパーゼ3 / 7、8または9の検出

概要

カスパーゼはアポトーシスプロセスにおいて主要な役割を担っています。このアッセイでは蛍光プローブにリンクされたカスパーゼ特異的阻害剤シーケンスを利用し、カスパーゼ活性を測定します。これはFluorochrome-Labeled Inhibitor of Caspases Assay (FLICA)として知られています。
非細胞毒性カスパーゼ特異的阻害剤は細胞透過性であり、インタクトの細胞膜を通過し、活性カスパーゼヘテロ二量体の大サブユニット上の反応性システイン残基に共有結合します。 結合していないカスパーゼ阻害剤は細胞外に拡散して洗い流されるため、プロカスパーゼまたは酵素の不活性型による干渉はありません。 したがって、測定された蛍光は、生細胞全体の活性カスパーゼの量を直接測定します。 非生細胞はヨウ化プロピジウムを使用して識別されます。

原理

NucleoCounter NC-3000™システムは、蛍光顕微鏡法と画像分析を使用して、カスパーゼ活性に基づいてアポトーシス細胞の検出を自動化します。 細胞をHoechst 33342、PIおよびカルボキシフルオレセイン標識FLICA試薬で染色します。総細胞集団はHoechst 33342で染色され、初期アポトーシス細胞および後期アポトーシス/壊死細胞はそれぞれ、カルボキシフルオレセイン標識FLICA試薬およびPIで染色されます。

結果はPlotManagerで表示されます。

図:Jurkat cellは、カンプトテシン(CPT)の非存在下(上段)または存在下(下段)で成長しました。 細胞をHoechst-33342、FLICA試薬(FAM)およびヨウ化プロピジウム(PI)で染色し、NucleoCounter®NC-3000™ Caspase Assayを使用して分析しました。 散布図とヒストグラムは、NucleoView™NC-3000™ソフトウェアから取得しました。 表示されたプロットのポリゴンとマーカーを使用して、さまざまな細胞集団を区別しました。 この例では、カンプトテシンは初期アポトーシス細胞(カスパーゼFAM陽性およびPI陰性細胞)の劇的な増加を引き起こします。

操作手順

消耗品

アネキシンVアッセイ

NC-3000™を使用したアネキシンVアッセイのアポトーシス解析

概要

細胞膜の内膜層から外膜層へのホスファチジルセリン(PS)の転移は、アポトーシスの初期に起こり、膜の完全性の喪失やDNA断片化などの他のアポトーシス現象よりも前に起こります。アネキシンは、カルシウム依存的にリン脂質に結合する細胞内タンパク質の一種です。 アネキシンVは、PSに対する親和性が高いため、アポトーシス細胞の検出に役立つツールであることが知られおり、蛍光標識アネキシンVを使用することで、PS転移を簡単に検出できます。 アネキシンVは後期アポトーシス細胞および壊死細胞のPSにも結合する可能性がありますが、これらの細胞の膜完全性が失われているため、膜を透過しないヨウ化プロピジウムの使用により初期アポトーシス細胞と区別できます。

原理

NucleoCounter®NC-3000™システムは、蛍光顕微鏡と画像解析を使用して、ホスファチジルセリンの外在化に基づいてアポトーシス細胞の検出を自動化します。 細胞をHoechst 33342、PIおよびFITC標識アネキシンVで染色します。Hoechst 33342は全細胞集団を染色し、アネキシンVはアポトーシス細胞および壊死細胞を染色します。 初期のアポトーシス細胞はPIを除外しますが、後期のアポトーシス細胞および壊死細胞はアネキシンVとPIの両方で陽性に染色されます。

結果はPlotManagerに表示されます

図:Jurkat細胞は、カンプトテシン(CPT)の非存在下(上段)または存在下(下段)で培養しました。 細胞をHoechst-33342、アネキシンV FITCコンジュゲートおよびヨウ化プロピジウム(PI)で染色し、NucleoCounter®NC-3000™ によって分析しました。 散布図とヒストグラムは、NucleoView™NC-3000™ソフトウェアから取得しました。 表示されたプロットのクアドラントとマーカーを使用して、さまざまな細胞集団を区別しました。 この例では、カンプトテシンは初期アポトーシス細胞(アネキシンV陽性およびPI陰性細胞)の劇的な増加を引き起こします。

操作手順

消耗品

ミトコンドリア膜電位アッセイ

NC-3000を使用したミトコンドリア膜電位アッセイの解析

概要

ミトコンドリア膜電位の喪失は、アポトーシスおよび化学的低酸素症による壊死に先行することが知られています。 脂溶性カチオン色素JC-1は、ミトコンドリア内で電位依存性の蓄積を示し、健康な細胞とアポトーシス細胞を区別するための簡単な蛍光の指標として使用できます。
健康な細胞では、無傷のミトコンドリア膜電位によって確立された負電荷により、ミトコンドリアマトリックスへのJC-1の蓄積が促進されます。
高濃度では、JC-1は凝集体を形成し赤色蛍光を示します。 アポトーシス細胞では、ミトコンドリアの電位が崩壊し、JC-1は単量体の緑色蛍光の形でサイトゾルに局在します。

原理

NucleoCounter NC-3000™システムは、蛍光顕微鏡法と画像解析を使用して、ミトコンドリア膜電位が崩壊した細胞の検出を自動化します。 細胞はJC-1およびDAPIで染色されます。

細胞のJC-1モノマーと凝集体は、それぞれ緑色と赤色の蛍光として検出されます。 ミトコンドリアの脱分極は、赤色/緑色蛍光強度比の減少として検出されます。 壊死および後期アポトーシス細胞は、青色蛍光(DAPI染色)を示します。

結果はPlotManagerに表示されます。

図:Jurkat細胞は、カンプトテシン(CPT)の非存在下(上段)または存在下(下段)で成長しました。 細胞をJC-1およびDAPIで染色し、ミトコンドリア電位アッセイおよびNucleoCounter®NC-3000™を使用して分析しました。 散布図とヒストグラムは、NucleoView™NC-3000™ソフトウェアから取得し、 表示されたプロットのポリゴンとマーカーを使用してさまざまな細胞集団を区別しました。 この例では、未処理の細胞は9%脱分極/アポトーシスであるのに対し、CPT処理細胞は61%脱分極/アポトーシスです。

操作手順

消耗品

アプリケーションノート