NucleoCounter ® NC-3000™を使用したGFPトランスフェクション効率アッセイの特徴

• ◆ 固定プロトコル – 設定は不要です
• ◆ 簡単操作 – サンプルをロードしてRunボタンをクリック
• ◆ 高い特異性 – 単一細胞レベルでトランスフェクションを評価
• ◆ 画像、散布図、GFP ヒストグラムで結果を視覚化
• ◆ 正確で再現性のある結果

GFP トランスフェクション効率アッセイの概要

真核細胞に外来遺伝子を導入して発現させる方法は、遺伝子の制御や機能を調べるために広く用いられている技術です。このような実験を行う場合、どの程度の割合の細胞が新しい遺伝子を取り込んだかを知ることが重要です。これは、プロセスの最適化およびダウンストリームでの結果の解釈に大きく影響するため、非常に重要な指標となります。

トランスフェクション効率を測定する簡単な方法として、緑色蛍光タンパク質（GFP）をレポーターとして使用する方法があります。適切なプロモーターを用いて、GFPを単独で、あるいは融合タンパク質として目的のタンパク質と同時に細胞内で発現させることが可能です。GFPレポーターシステムを用いることで、細胞集団全体におけるGFPを発現している細胞の割合として、トランスフェクション効率を容易に求めることができます。

NucleoCounter^® NC-3000™は、ユーザーフレンドリーなGFPトランスフェクション効率アッセイを搭載しており、非常に少ないサンプル量で測定が可能です。NucleoCounter^® NC-3000™ によるGFPトランスフェクション効率のためのサンプル調製は、迅速かつ簡単です。サンプルにSolution 15と16を加え、37℃でインキュベートし、サンプルをNC-Slide A2™にロードするだけです（ハイスループットの場合は、NC-Slide A8™を使用します）。数分以内に、最大8つのサンプルについて、散布図とヒストグラムで表示された画像と対応するデータを見ることができます。

アッセイ原理

蛍光染色とイメージビュー

・Hoechst 33342（青色）を用いて細胞を染色し、GFP発現細胞の割合（緑色）を容易に決定することができます。非生細胞はヨウ化プロピジウム（PI；赤）で染色されます。

・付属のNucleoView™ソフトウェアでは、Hoechst 33342で染色した細胞はすべて青く表示されます。

NucleoCounter® NC-3000™ のGFP Transfection Efficiency Assayから取得した画像は、対応する散布図を用いて定量化されます。

NucleoView™ソフトウェアを使用すると、蛍光データ画像内の集団や単一細胞を識別して選択し、対応する散布図上の位置を確認することができます。これにより、単一細胞のGFPおよびPI強度の完全なトレーサビリティが可能になり、解析対象の細胞を正確に特定し、染色状態を視覚的に確認することができるようになります。
したがって、GFP+細胞とGFP-細胞の間に明確なゲートを設定することができ、また生細胞と死細胞の区別を明確にすることが出来ます。

このように、データの生成と確認が2段階で行えることは、NucleoCounter® NC-3000™の利点です。NucleoView™ ソフトウェアでは、ゲートをテンプレートやプロトコルとして作成・保存できるため、次回以降のランに適用することができ、解析時間を最小限に抑えることができます。

蛍光イメージ中の細胞と散布図の相関

GFPトランスフェクション効率アッセイで撮影された画像には、対応するプロット図も作成されます。ユーザーは、ある細胞群や単一の細胞を選択して、対応する散布図上でそれらの各プロットの位置を確認できます。 これにより、ユーザーはゲーティングしている細胞をイメージ上で確認し、GFP(+)細胞とGFP(-)細胞、および生細胞と死細胞の間に明確な閾値を設定できます。

図3.蛍光イメージとプロット図でそれらの対応する位置の視覚化

単一細胞レベルで、陽性染色細胞と陰性染色細胞の間に厳密な閾値を設定することができ、特定の細胞集団の染色パターンを蛍光イメージから観察できます。

図4.蛍光イメージに基づいてGFP +細胞のゲートを設定します。

図5.ヨウ化プロピジウム(PI)染色に基づく死細胞ゲートの設定。

NucleoView™ソフトウェアによる解析

解析テンプレートの作成と保存

NucleoView™ソフトウェアを使用すると、プロット図のゲーティングを含む解析テンプレートを作成して保存できます。 プロトコルとして保存することで、ユーザーはこの解析テンプレートを次の測定時にすぐ適用でき、解析にかかる時間を最小限に抑えることができます。

データの出力

NucleoView™ソフトウェアでの解析データを、スプレッドシートにエクスポートできます。

消耗品

品番	品名	容量	用途
942-0001	NC‐Slide A2	25枚	全アッセイ共通(NC-250・NC-3000）
942-0003	NC‐Slide A8	25枚	全アッセイ共通(NC-250・NC-3000）
910-3015	Solution 15	1ｍL	Annexin V/ Caspase/ GFP Transfection
910-3016	Solution 16	1ｍL	Annexin V/ Caspase/ GFP Transfection

アプリケーションノート