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ELISPOTアッセイの概要

ELISPOTは免疫モニタリングの手法として理想的なアッセイです。
CTL社の ELISPOT Kitを使用することで、様々なラボに所属する初めてELISPOTを行うユーザーが、ELISPOTアッセイを実行する1回目の試みで正確なデータを取得することができました。（Zhang et al., J. Immunotoxicology, 2009, 6：227）

他の手法と比較したELISPOTアッセイの利点

卓越した感度
vs ELISA、CBA（サイトカインビーズアレイ）

ELISPOTアッセイは、細胞を取り巻く直近の細胞環境で 刺激されたT細胞から放出されたサイトカイン（またはB細胞 ELISPOTの抗体）を検出します。 T細胞は、アッセイ中に キャプチャー用抗体でコーティングされた膜上で培養され、 抗原またはポリクローナルマイトジェンを介して刺激すると、 T細胞はサイトカインを放出し、その時点でサイトカインはキャプチャー抗体に結合します。したがってELISPOTアッセイは、サイトカインが培地で希釈されてしまう、または分解されてしまう恐れのあるELISAやサイトカインビーズアレイ（CBA）などの間接的なアッセイよりもはるかに高い感度で、放出されたサイトカインを測定できます。

vs フローサイトメトリー/ICS(細胞内サイトカイン染色）

ELISPOTアッセイはフローサイトメトリーを使用した細胞内サイトカイン染色(intracellular cytokine staining：ICS)よりも桁違いに高感度です。ICSでは細胞内にサイトカインを留めて検出する必要があり、そのための処理でダメージを受けた細胞を使用して行われます。したがって、ICSで検出されるサイトカインは必ずしも生理活性に関連があるわけではありません。

CTLが提供するELISPOTアッセイプラットフォームであるImmunoSpotアッセイでは、PBMCを使用して0.0001%という低い頻度で抗原特異的T細胞を検出できます。つまり、100万個の近傍に存在するバイスタンダー細胞から単一のサイトカイン分泌T細胞を検出可能です。

サイトカイン検出を目的としたenzyme-linked immunosorbent spot assay(ELISPOT)の原理

(A)　ウェル底面がPVDFメンブレンとなっているELISPOT用プレートにキャプチャー抗体をコートします。

(B)　単離した細胞または解凍した細胞を抗原と共にインキュベートすることで抗原特異的T細胞を活性化し、サイトカイン分泌が誘導されます。

(C)　細胞は取り除かれ、サイトカインが結合した抗体のみがウェル上に残ります。

(D)　検出用抗体を添加し検出します。この図では検出用抗体に直接酵素がラベルされています。検出はストレプトアビジン-ビオチン系を使用し間接的に検出することも可能です。

(E)　発色基質を添加することでキャプチャーされたサイトカインがスポットとして発色されます。

CTL ImmunoSpotプラットフォーム

ELISPOTアッセイは新しく単離されたfresh PBMC、または 最適化されたプロトコールに従って凍結保存後、溶解したPBMCを使って行うことができます。 CTL社が提供するImmunoSpot®キットに加えて、CTLは抗原と共に、その抗原に対する反応性が定義されたPBMCをセットにした ePBMC® Reference Sample QC Setをご用意しております。このようなリファレンスサンプルはアッセイの開発および検証に不可欠です。

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ImmunoSpotキットには96ウェルPVDFプレートにサイトカイン特異的キャプチャー抗体（例えばanti-IFNγ）が既にコーティングされたプレコートキットとユーザー自身で抗体をコートするキットがあります。PBMC（または抗原提示細胞を含む単離T細胞）は、事前にコーティングされたウェルに添加され、抗原と共に培養されます。ネガティブコントロールウェルには、無関係の抗原または培地のみを添加します。ポジティブコントロールとして、CD8細胞を刺激するCEFペプチドやCD４細胞を活性化する不活化CMVウイルス、両T細胞サブセットを刺激するためのPHAを抗原として添加します。

ELISPOTアッセイで最良の結果を得るためには、サイトカイン（またはほかの分泌物）産生に必要な期間、細胞と抗原を培養する必要があります。最適な培養時間はサイトカインの種類によって異なり、例えばIFN-γ分泌には24時間が最適です。活性化培養の後、細胞はプレートから除去され、さらなる特性評価などのために再利用することが可能です。次にサイトカイン特異的検出抗体を添加し、プレートに結合した検出抗体を酵素反応または蛍光で可視化します。ImmunoSpotアッセイは単一細胞の分泌活性のフットプリントを色素の「スポット」で検出できるように最適化されています。したがってスポット数は、培養した細胞中の抗原特異的T細胞の正確な頻度を示しています。さらにスポットサイズと形態は、細胞の分泌活性の大きさと動態に関する追加情報を提供します。

CTL社 ELISPOTキット(ImmunoSpot kit)特徴

エラーとばらつきの排除

◆クリアな発色基質
NBTに比べクリアな発色のCTL-BlueとCTL-Redを発色基質として使用しており、NBT発色のように青色が紫色になることがありません。蛍光を使用することなく、発色のダブルカラーアッセイで、マルチファンクショナル細胞をそれ以外と明確に区別できます。（上の図）
◆効率化されたプロトコール
従来法や他社キットと比較し、以下の工程が省かれています。
-エタノール使用のプレウエットと洗いのステップ
-ブロッキングと洗いのステップ
◆プレコートキットもご用意
より工程数が少なく均一性も高い、キャプチャー抗体をプレコート済みの製品も用意しています。
◆固定された発色時間
プロトコールで発色時間を規定しており、目視で発色時間の調整が不要のため、オペレーターの主観が入ることを排除します。
◆培地も含むコンプリートキット
非特異的な反応の増強/抑制の発生頻度を最小化するように最適化されています。血清入り培地はロット間差があるため試験結果の信頼性が損なわれる可能性があり、標準化された代替培地としてCTL-TEST Mediumがキットに含まれています。

高い利便性

◆96ウエルプレートのほかに、8ウエルずつ利用できるストリップタイププレートのキットも用意しています。FAQページ"一度に96wellもアッセイする必要が無いのですが。"も併せてご覧ください。
◆ヒト用キットには、カニクイザル、アカゲザルと交差性のあるキットもあります。
◆FluoroSpotキットでは、最大4ターゲット検出のキットを用意しています。

製品ラインナップ

ダブルカラー発色ELISPOTキット、2カラー以上のFluoroSpotキットについては
マルチプレックスELISPOT/FluoroSpotキットのページをご覧ください。

シングルカラーELISPOT/FluoroSpot kit

　　　

T細胞発色/蛍光 シングルカラー	ヒト/Human	霊長類/NHP 種別交差表	マウス/Mouse	ラット/Rat	ブタ/Pig
IFN-γ	〇	〇	〇	〇	〇
New IFN-γ-Rapid >>製品詳細	〇(発色のみ）	〇(発色のみ）
IL-2	〇	〇	〇
IL-4	〇	〇	〇
IL-5	〇	△	〇
IL-6	〇	〇	〇
IL-10	〇	〇	〇
IL-12	〇	△
IL-13	〇	〇
IL-17	〇	〇	〇
IL-21	〇	×
IL-22	〇	×
TNF-α	〇	〇	〇
Granzyme B	〇	×
Perforin	〇	〇
GM-CSF	〇	〇

霊長類/NHPはヒト用キットとの交差性を確認したものです。【カニクイザル/Cynomolgus macaques、アカゲザル/Rhesus macaques、サバンナモンキー/African green monkey、ブタオザル/Pig-tailed Macaque】

キット構成

構成品	内容	内容量
PVDFメンブレンプレート	96wellホワイトプレートまたは8wellストリッププレート	2枚、5枚、10枚のいずれか
CTL TEST Medium	無血清培地	100mL/2枚入り、100mL×2本/5枚入り、500mL/10枚入り
キャプチャー抗体	プレコートプレートの場合は添付無し	キット内容による
検出用抗体	ビオチンまたはFITCラベル抗体	キット内容による
標識済みターシャリー	ストレプトアビジン-AP、抗FITC抗体-HRP、蛍光標識ストレプトアビジン、蛍光標識抗FITC抗体のいずれか	キット内容による
発色基質	CTL-TrueBlue、CTL-TrueRed、BCIPより選択可（発色キットのみ）	キット内容による
基質希釈液	発色キットのみ添付	キット内容による
プロトコール

法規制等

カルタヘナ法はすべて非該当です。
　 　 　 　 　 　

製品群	毒劇	化管法 (第1種指定）	化管法 (第2種指定)	労働安全衛生法	日本語SDS
発色シングルカラー Kit（例外あり）	-	-	-	該当 メタノール	SCE-SDS
発色シングルカラー Kit hIL6-1M, hIL6-2M, hIL13-1M, hIL13-2M	劇物（チメロサール）	-	-	該当 メタノール	h-il6il13_SCE-SDS
蛍光シングルカラー Kit（例外あり）	-	-	-	-
蛍光シングルカラー Kit human IL-6, IL-13プレコートキット以外	劇物（チメロサール）	-	-	-	h-il6il13_SCF-SDS

型番からプレーコートの有無や動物種を知る方法については、FAQsをご覧ください。

関連製品

　　　　

ELISPOT解析受託サービス	ELISPOTアナライザー	B細胞ELISPOTキット	マルチプレックスELISPOT/FluoroSpotキット
ヒト末梢血単核球（PBMC)	抗原とポジティブコントロール	C.T.L社無血清培地と各種試薬	ELISPOTキット 製品検索

プロトコール

アプリケーションノート