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B Cell ELISPOT Assayの概要

1983年にセシル・チェルキンスキーによって免疫グロブリン分泌B細胞を検出するために開発されたELISPOT技術は、単一クラスの免疫グロブリンをモニターするための非常に感度の高いツールです。

B細胞は、生体内で適切な刺激を受けると、リンパ芽球／プラズマブラストの表現型を獲得し、独自のB細胞受容体である免疫グロブリン（Ig）（一般的には抗体と呼ばれる）を分泌し始めます。このようなIgを分泌するプラスマブラストは、抗体分泌細胞（ASC）としても知られており、B cell ImmunoSpot®アッセイにより数をカウントすることができます。しかし、安静時のメモリーB細胞をB cell ImmunoSpot®アッセイで検出するためには、事前にin vitroで刺激してIg分泌型プラスマブラストに分化させる必要があります。CTL社のキットでは、抗体を分泌するB細胞をex vivoで直接、またはin vitroで事前に刺激した後に測定することができます。

トータルIg検出

CTL社のキットでは、キャプチャー抗体としてIg特異的抗体が添付されており、プレート底のメンブレンに固定されます。B細胞が放出する抗体は、クラス、サブクラス、もしくは抗原特異性とは無関係にこのキャプチャー抗体によって結合されます。

抗原特異的なIg産生細胞の検出

メンブレンをIg Capture Antibodyではなく、抗原そのものでコーティングします。本メソッドの活用によって、ASCから放出された抗原特異的な抗体のみが、メンブレンと結合した抗原と結合します。このような抗原と結合した状態の抗原特異的な抗体は、トータルIgと同様の検出手法で検出できます。
抗原のコーティング条件は、それぞれの抗原によって最適化してやる必要があります。

マルチプレックスの利点

また、シングルターゲットアッセイでは、複数のIgクラス/サブクラスの包括的な研究が難しくなり、追加の細胞材料、抗原、および労力が必要になります。 デュアルカラーB細胞FluoroSpotアッセイが利用可能になったため、IgクラスまたはIgGサブクラスの異なる組み合わせの検出を同時に促進することで、抗原刺激に対するB細胞応答の機能性に関する適切な洞察を得る能力が大幅に拡大しました。

アッセイの原理（トータルIgGの場合）

メンブレンにはAnti-human Igκ/λ Capture Ab (紺色で表示)がコートされています。
B細胞が抗体（灰色で表示）を分泌すると、これらの抗体はクラス、サブクラス、抗原特異性に関係なく、直接キャプチャーされます。プレートに結合したIgGは、ビオチン化した抗ヒトIgG抗体を添加した後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ（SA-AP）と3つのサブコンポーネント（S1、S2、S3）からなる基質を添加することで検出され、青色の沈殿物または「スポット」が生成されます。

製品ラインナップ

ダブルカラー発色ELISPOTキット、2カラー以上のFluoroSpotキットについては
マルチプレックスELISPOT/FluoroSpotキットのページをご覧ください。

B細胞シングルカラーキット/ Single Color B cell ImmunoSpot kit

下の表の各製品をクリックすると製品検索ページに移動します。
　　　

	ヒト/Human	霊長類/NHP	マウス/Mouse	ブタ/Pig	New  フェレット/Ferret
IgG	〇	〇(C)	〇	-	〇
IgA	〇	〇(C)	〇	〇	-
New IgA1	〇	-	-	-	-
New IgA2	〇	-	-	-	-
IgM	〇	〇(C)(R)	〇	-	-
IgE	〇	-	〇	-	-
IgG1	〇	-	〇	-	-
IgG2	〇	-	-	-	-
IgG3	〇	-	〇	-	-
IgG4	〇	-	-	-	-
IgG2a	-	-	〇(Balb/c)*	-	-
IgG2b	-	-	〇	-	-
New IgG2c	-	-	○(C57BL/6)*	-	-
New Igκ	-	-	-	-	〇
New Igλ	-	-	-	-	〇

カニクイザル/Cynomolgus: (C)、アカゲザル/Rhesus: (R)
*Balb/c (IgHa)のみ、C57BL/6(IgHb)のみ
その他IgM、IgA、IgG、IgE、IgG1、IgG3、IgG2bはマウス系統C57BL/6、BALB/c両方で交差反応性あり

キット構成

◆ B-Poly-S^※
単独で購入可能です。（ページ下） 保存について：2～8℃で7日間まで冷蔵保存可能です。
長期保存の場合は、-20℃以下の保存が推奨されますが、凍結/融解の繰り返しを避けるために小分けの上、保存してください。
◆ PVDFメンブレンプレート
◆ Igキャプチャー抗体
◆ Biotinラベル検出抗体
◆ Strep-AP
◆ 基質と希釈液
◆ プロトコール
※Ferretキットを除く

関連試薬：ポリクローナルB Cell Activator

メモリーB細胞は、直近で抗原に遭遇していない静止状態で存在し、個々のB細胞抗原受容体（BCR）を可溶性抗体として分泌しません。 従って、ELISPOTやFluoroSpot（ImmunoSpotと総称）測定には、休止状態のメモリーB細胞へのポリクローナル刺激が必要となります。 ImmunoSpotアッセイにおいて、ほとんどのin vitro ASC測定には4~7日間の前刺激培養が推奨されます。

■CTL社B細胞ELISPOTおよびFluoroSpotキットには、あらかじめ適したB-Poly-S試薬が添付されています。

CTL Human B-Poly-S™ (品番：CTL-HBPOLYS-80, CTL-HBPOLYS-200)

Human B-Poly-S™は、ポリクローナル刺激と、IgA、IgMおよび4つのIgGサブクラスすべてを産生する抗体分泌細胞（ASC）へのB細胞の分化を促進します。

製品内容

CTL Human B-Poly-Sは、Resiquimodと組換えHuman IL-2を含むストック溶液です。

使用について

多くのin vitro ASCアプリケーションでは、4-6日間の細胞の事前刺激が推奨されます。
滅菌環境において、10 mLの培地当たり10 μLのCTL B-Poly-S™を添加します。未分画のPBMCや脾臓細胞では、1-4 x 10^6/mlの初期細胞濃度が適していますが、分離されたB細胞を培養する場合は、2～5 x 10^4 /mlの初期細胞密度をお勧めします。
詳細はデータシートをご覧ください。

CTL Human B-Poly-SE™ (品番：CTL-HBPOLYSE-35, CTL-HBPOLYSE-160)

CTL Human B-Poly-SE™は、B細胞のポリクローナル刺激と抗体分泌細胞（ASC）への分化を促進することが示されています。特に、B-Poly-SE™はIgM+ B細胞レセプターを発現するナイーブB細胞の分化を阻害し、IgEを含むすべてのIgクラスおよびIgGサブクラスの産生を誘導することができます。

製品内容

CTL Human B-Poly-Sは、抗CD40モノクローナル抗体と組換えHuman IL-4、組換えHuman IL-21を含むストック溶液です。

使用について

多くのin vitro ASCアプリケーションでは、4-6日間の細胞の事前刺激が推奨されます。
滅菌環境において、10 mLの培地当たり30 μLのCTL B-Poly-SE™を添加します。未分画のPBMCや脾臓細胞では、1-4 x 10^6/mlの初期細胞濃度が適していますが、分離されたB細胞を培養する場合は、2～5 x 10^4 /mlの初期細胞密度をお勧めします。
B-Poly-SE™は、個々のIgクラス（IgEを含む）を分泌できる抗体分泌細胞（ASC）の分化を誘導します。 詳細はデータシートをご覧ください。

CTL Mouse B-Poly-S™ (品番：CTL-MBPOLYS-80, CTL-MBPOLYS-200)

Mouse B-Poly-S™はポリクローナル刺激を促進し、B細胞をIgA、IgG、IgMを産生する抗体分泌細胞（ASC）に分化させます。

製品内容

CTL Mouse B-Poly-Sは、Resiquimodと組換えMoue IL-2を含むストック溶液です。

使用について

多くのMouse in vitro ASCアプリケーションでは、3-5日間の細胞の事前刺激が推奨されます。
滅菌環境において、10 mLの培地当たり10 μLのCTL B-Poly-S™を添加します。未分画のPBMCや脾臓細胞では、1-4 x 10^6/mlの初期細胞濃度が適していますが、分離されたB細胞を培養する場合は、2～5 x 10^4 /mlの初期細胞密度をお勧めします。
B-Poly-SE™は、個々のIgクラス（IgEを含む）を分泌できる抗体分泌細胞（ASC）の分化を誘導します。 詳細はデータシートをご覧ください。

価格表

※保存について：2～8℃で7日間まで冷蔵保存可能です。
長期保存の場合は、-20℃以下の保存が推奨されますが、凍結/融解の繰り返しを避けるために小分けの上、保存してください。

関連情報

　　　　

ELISPOT解析受託サービス	T細胞ELISPOTキット	ELISPOTアナライザー	マルチプレックスELISPOT/FluoroSpotキット
ヒト末梢血単核球（PBMC)	抗原とポジティブコントロール	C.T.L社無血清培地と各種試薬	ELISPOTキット 製品検索

法規制等

　

製品群	毒劇	化管法 (第1種指定）	化管法 (第2種指定)	労働安全衛生法	日本語SDS
B cell 発色 Kit	-	-	-	該当 メタノール	SCE-SDS
CTL-hBPOLYS-200 CTL-hBPOLYSE-200 CTL-mBPOLYS-200	-	-	-	-	-

CTL社 ImmunoSpot Kitはすべてカルタヘナ非該当です。

プロトコール

アプリケーションノート