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B Cell ELISPOT Assayの概要

B細胞ELISPOTは、免疫グロブリン分泌B細胞を検出するために開発されました。単一クラスの免疫グロブリンをモニターするための非常に感度の高いツールです。

B細胞は、生体内で適切な刺激を受けると、リンパ芽球／プラズマブラスト（抗体産生形質細胞）の表現型を獲得し、独自のB細胞受容体である免疫グロブリン（Ig）（一般的には抗体と呼ばれる）を分泌し始めます。このようなIgを分泌するプラスマブラストは、抗体分泌細胞（ASC）としても知られており、B cell ImmunoSpot®アッセイにより存在頻度を計測することができます。しかし、安静時のメモリーB細胞をB cell ImmunoSpot®アッセイで検出するためには、事前にin vitroで刺激してIg分泌型プラスマブラストに分化させる必要があります。CTL社のキットでは、抗体を分泌するB細胞をex vivoで直接、またはin vitroで事前に刺激した後に測定することができます。

ELISPOT/FluoroSpot法の主な長所は、血液中の抗原反応性メモリーB細胞の計数を可能にすることで、メモリーB細胞プールの規模や、各メモリー細胞によって産生される抗体クラス/サブクラスに関する洞察を提供し、B細胞メモリーの質を明らかにすることができることです。また、もう一つの利点は、B細胞はPBMC中の分泌抗体の唯一の供給源であるため、事前にB細胞を分離／選別する必要がなく、PBMCを用いてアッセイを実施できることです。

トータルIg ASCと抗原特異的Ig ASCの検出

(A)Total Ig(G) ASCの検出：PVDF膜を高密度にコーティングしたpan-Ig(ライトグレー)により、ヒトIgG(青)が補足され、検出用の抗ヒトIg抗体(茶色)により視覚化される。

(B)抗原特異的Ig(G) ASCの検出：PVDF膜を高密度にコーティングした抗アフィニティータグ特異的抗体※により、抗原によるメンブレンのコーティングが行われる。抗原特異的ASCにより分泌されたヒトIgは、検出用の抗ヒトIg抗体(茶色)により視覚化される。 ※PVDF膜を抗原で直接コートする方法は、高密度なコーティングが困難であるためアフィニティータグを使ったコーティング方が開発された。

出典："Monitoring Memory B Cells by Next-Generation ImmunoSpot® Provides Insights into Humoral Immunity that Measurements of Circulating Antibodies Do Not Reveal"
Alexander E. Kalyuzhny (ed.), Handbook of ELISPOT: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 2768 https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3690-9_11, © The Author(s) 2024

アッセイに使用する細胞（B細胞由来の抗原産生細胞(ASC)）の違い

生体内で活性化された状態（目安：抗原曝露から1週間後～）：プラズマブラスト

⇒サンプルを、ELISPOTアッセイにすぐ利用可能

生体内で活性化されていない状態：メモリーB細胞（Bmem)

→サンプルを、In vitroでポリクローナル刺激（約５日）してからELISPOTアッセイに適用
　　　・IgA/IgG/IgM ：R848 (1 µg/ml) + rIL-2 (10 ng/ml)
　　　・IgE ：anti-CD40 (1 µg/ml)+ rIL-4 (30 ng/ml) + rIL-21 (50 ng/ml)

これらのポリクローナル刺激用の試薬は、CTL B-Poly-S試薬として単品販売しており、ほとんどのキットにあらかじめ同梱されています。

参考：アフィニティーに基づく抗体分泌形質細胞とメモリーB細胞の分化

二次リンパ組織(例：リンパ節)において、ナイーブB細胞("B_naive")は、そのB細胞受容体(BCR)が活性化を引き起こすのに十分な親和性を有する濾胞樹状細胞("FDC")によって提示される抗原("Ag")に遭遇する。B細胞はBCRが獲得した抗原由来のペプチドを濾胞ヘルパーT細胞("T_FH")に提示し、両細胞の活性化/局在化および増殖が生じる。
→　その後、B細胞はリンパ節内の胚中心に入り、増殖とBCRの体細胞超変異("SHM")を繰り返す。SHMはランダムであり、娘細胞は抗原に対して幅広い親和性を持つBCRを示す。
→親和性の高いBCRを持つ細胞は正選択され、増殖と更なるSHM、親和性による正選択のサイクルを経て最終的に抗体分泌形質細胞（PC）へ分化する。
→　より親和性の低いBCRバリアントを発現する娘細胞は、B_memとしてリンパ節から排出される。交差反応性によっては、これらのB_memは変異型の抗原に対して高い親和性を持つ可能性がある。

出典："Monitoring Memory B Cells by Next-Generation ImmunoSpot® Provides Insights into Humoral Immunity that Measurements of Circulating Antibodies Do Not Reveal"
Alexander E. Kalyuzhny (ed.), Handbook of ELISPOT: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 2768 https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3690-9_11, © The Author(s) 2024

CTL社B細胞ELISPOTキット 製品ラインナップ

ダブルカラー発色ELISPOTキット、2カラー以上のFluoroSpotキットについては
マルチプレックスELISPOT/FluoroSpotキットのページをご覧ください。

B細胞シングルカラーキット/ Single Color B cell ImmunoSpot kit

下の表の各製品をクリックすると製品検索ページに移動します。
　　　

	ヒト/Human	霊長類/NHP	マウス/Mouse	ブタ/Pig	New  フェレット/Ferret
IgG	〇	〇(C)	〇	-	〇
IgA	〇	〇(C)	〇	〇	-
New IgA1	〇	-	-	-	-
New IgA2	〇	-	-	-	-
IgM	〇	〇(C)(R)	〇	〇	-
IgE	〇	-	〇	-	-
IgG1	〇	-	〇	-	-
IgG2	〇	-	-	-	-
IgG3	〇	-	〇	-	-
IgG4	〇	-	-	-	-
IgG2a	-	-	〇(Balb/c)*	-	-
IgG2b	-	-	〇	-	-
New IgG2c	-	-	○(C57BL/6)*	-	-
New Igκ	-	-	-	-	〇
New Igλ	-	-	-	-	〇

カニクイザル/Cynomolgus: (C)、アカゲザル/Rhesus: (R)
*Balb/c (IgHa)のみ、C57BL/6(IgHb)のみ
その他IgM、IgA、IgG、IgE、IgG1、IgG3、IgG2bはマウス系統C57BL/6、BALB/c両方で交差反応性あり

キット構成

◆ B-Poly-S^※
単独で購入可能です。（ページ下） 保存について：2～8℃で7日間まで冷蔵保存可能です。
長期保存の場合は、-20℃以下の保存が推奨されますが、凍結/融解の繰り返しを避けるために小分けの上、保存してください。
◆ PVDFメンブレンプレート
◆ Igキャプチャー抗体
◆ Biotinラベル検出抗体
◆ Strep-AP
◆ 基質と希釈液
◆ プロトコール
※Ferretキットを除く

関連試薬：ポリクローナルB Cell Activator

メモリーB細胞は、直近で抗原に遭遇していない静止状態で存在し、個々のB細胞抗原受容体（BCR）を可溶性抗体として分泌しません。 従って、ELISPOTやFluoroSpot（ImmunoSpotと総称）測定には、休止状態のメモリーB細胞へのポリクローナル刺激が必要となります。 ImmunoSpotアッセイにおいて、ほとんどのin vitro ASC測定には4~7日間の前刺激培養が推奨されます。

■CTL社B細胞ELISPOTおよびFluoroSpotキットには、あらかじめ適したB-Poly-S試薬が添付されています。

CTL Human B-Poly-S™ (品番：CTL-HBPOLYS-80, CTL-HBPOLYS-200)

Human B-Poly-S™は、ポリクローナル刺激と、IgA、IgMおよび4つのIgGサブクラスすべてを産生する抗体分泌細胞（ASC）へのB細胞の分化を促進します。

製品内容

CTL Human B-Poly-Sは、Resiquimodと組換えHuman IL-2を含むストック溶液です。

使用について

多くのin vitro ASCアプリケーションでは、4-6日間の細胞の事前刺激が推奨されます。
滅菌環境において、10 mLの培地当たり10 μLのCTL B-Poly-S™を添加します。未分画のPBMCや脾臓細胞では、1-4 x 10^6/mlの初期細胞濃度が適していますが、分離されたB細胞を培養する場合は、2～5 x 10^4 /mlの初期細胞密度をお勧めします。
詳細はデータシートをご覧ください。

CTL Human B-Poly-SE™ (品番：CTL-HBPOLYSE-35, CTL-HBPOLYSE-160)

CTL Human B-Poly-SE™は、B細胞のポリクローナル刺激と抗体分泌細胞（ASC）への分化を促進することが示されています。特に、B-Poly-SE™はIgM+ B細胞レセプターを発現するナイーブB細胞の分化を阻害し、IgEを含むすべてのIgクラスおよびIgGサブクラスの産生を誘導することができます。

製品内容

CTL Human B-Poly-Sは、抗CD40モノクローナル抗体と組換えHuman IL-4、組換えHuman IL-21を含むストック溶液です。

使用について

多くのin vitro ASCアプリケーションでは、4-6日間の細胞の事前刺激が推奨されます。
滅菌環境において、10 mLの培地当たり30 μLのCTL B-Poly-SE™を添加します。未分画のPBMCや脾臓細胞では、1-4 x 10^6/mlの初期細胞濃度が適していますが、分離されたB細胞を培養する場合は、2～5 x 10^4 /mlの初期細胞密度をお勧めします。
B-Poly-SE™は、個々のIgクラス（IgEを含む）を分泌できる抗体分泌細胞（ASC）の分化を誘導します。 詳細はデータシートをご覧ください。

CTL Mouse B-Poly-S™ (品番：CTL-MBPOLYS-80, CTL-MBPOLYS-200)

Mouse B-Poly-S™はポリクローナル刺激を促進し、B細胞をIgA、IgG、IgMを産生する抗体分泌細胞（ASC）に分化させます。

製品内容

CTL Mouse B-Poly-Sは、Resiquimodと組換えMoue IL-2を含むストック溶液です。

使用について

多くのMouse in vitro ASCアプリケーションでは、3-5日間の細胞の事前刺激が推奨されます。
滅菌環境において、10 mLの培地当たり10 μLのCTL B-Poly-S™を添加します。未分画のPBMCや脾臓細胞では、1-4 x 10^6/mlの初期細胞濃度が適していますが、分離されたB細胞を培養する場合は、2～5 x 10^4 /mlの初期細胞密度をお勧めします。
B-Poly-SE™は、個々のIgクラス（IgEを含む）を分泌できる抗体分泌細胞（ASC）の分化を誘導します。 詳細はデータシートをご覧ください。

価格表

※保存について：2～8℃で7日間まで冷蔵保存可能です。
長期保存の場合は、-20℃以下の保存が推奨されますが、凍結/融解の繰り返しを避けるために小分けの上、保存してください。

関連情報

　　　　

ELISPOT解析受託サービス	T細胞ELISPOTキット	ELISPOTアナライザー	マルチプレックスELISPOT/FluoroSpotキット
ヒト末梢血単核球（PBMC)	抗原とポジティブコントロール	C.T.L社無血清培地と各種試薬	ELISPOTキット 製品検索

法規制等

　

製品群	毒劇	化管法 (第1種指定）	化管法 (第2種指定)	労働安全衛生法	日本語SDS
B cell 発色 Kit	-	-	-	該当 メタノール	SCE-SDS
CTL-hBPOLYS-200 CTL-hBPOLYSE-200 CTL-mBPOLYS-200	-	-	-	-	-

CTL社 ImmunoSpot Kitはすべてカルタヘナ非該当です。

プロトコール

アプリケーションノート