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ELISPOTアッセイの概要

希少な抗原特異的T細胞やB細胞を確実に検出することは、免疫モニタリングの大きな課題でした。
ELISPOTアッセイは、ターゲット細胞を取り巻く近傍細胞そのままの細胞環境で、刺激されたT細胞から放出されたサイトカインを検出することが可能です。 ELISPOTは免疫モニタリングの手法として理想的なアッセイです。

ELISPOTアッセイの基本について

サイトカイン検出を目的としたenzyme-linked immunosorbent spot assay(ELISPOT)の原理

　　　　

ELISPOTの検出原理>> ELISPOTとは

CTL ImmunoSpotプラットフォーム

ELISPOTアッセイは新しく単離されたfresh PBMC、または 最適化されたプロトコールに従って凍結保存後、溶解したPBMCを使って行うことができます。 CTL社が提供するImmunoSpot®キットに加えて、CTLは抗原と共に、その抗原に対する反応性が定義されたPBMCをセットにした ePBMC® Reference Sample QC Setをご用意しております。このようなリファレンスサンプルはアッセイの開発および検証に不可欠です。

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ImmunoSpotキットには96ウェルPVDFプレートにサイトカイン特異的キャプチャー抗体（例えばanti-IFNγ）が既にコーティングされたプレコートキットとユーザー自身で抗体をコートするキットがあります。PBMC（または抗原提示細胞を含む単離T細胞）は、事前にコーティングされたウェルに添加され、抗原と共に培養されます。ネガティブコントロールウェルには、無関係の抗原または培地のみを添加します。ポジティブコントロールとして、CD8細胞を刺激するCEFペプチドやCD４細胞を活性化する不活化CMVウイルス、両T細胞サブセットを刺激するためのPHAを抗原として添加します。

ELISPOTアッセイで最良の結果を得るためには、サイトカイン（またはほかの分泌物）産生に必要な期間、細胞と抗原を培養する必要があります。最適な培養時間はサイトカインの種類によって異なり、例えばIFN-γ分泌には24時間が最適です。活性化培養の後、細胞はプレートから除去され、さらなる特性評価などのために再利用することが可能です。次にサイトカイン特異的検出抗体を添加し、プレートに結合した検出抗体を酵素反応または蛍光で可視化します。ImmunoSpotアッセイは単一細胞の分泌活性のフットプリントを色素の「スポット」で検出できるように最適化されています。したがってスポット数は、培養した細胞中の抗原特異的T細胞の正確な頻度を示しています。さらにスポットサイズと形態は、細胞の分泌活性の大きさと動態に関する追加情報を提供します。

CTL社 ELISPOTキット(ImmunoSpot kit)特徴

エラーとばらつきの排除

◆クリアな発色基質
NBTに比べクリアな発色のCTL-BlueとCTL-Redを発色基質として使用しており、NBT発色のように青色が紫色になることがありません。蛍光を使用することなく、発色のダブルカラーアッセイで、マルチファンクショナル細胞をそれ以外と明確に区別できます。（上の図）
◆効率化されたプロトコール
従来法や他社キットと比較し、以下の工程が省かれています。
-エタノール使用のプレウエットと洗いのステップ
-ブロッキングと洗いのステップ
◆プレコートキットもご用意
より工程数が少なく均一性も高い、キャプチャー抗体をプレコート済みの製品も用意しています。
◆固定された発色時間
プロトコールで発色時間を規定しており、目視で発色時間の調整が不要のため、オペレーターの主観が入ることを排除します。
◆培地も含むコンプリートキット
非特異的な反応の増強/抑制の発生頻度を最小化するように最適化されています。血清入り培地はロット間差があるため試験結果の信頼性が損なわれる可能性があり、標準化された代替培地としてCTL-TEST Mediumがキットに含まれています。

高い利便性

◆96ウエルプレートのほかに、8ウエルずつ利用できるストリップタイププレートのキットも用意しています。FAQページ"一度に96wellもアッセイする必要が無いのですが。"も併せてご覧ください。
◆ヒト用キットには、カニクイザル、アカゲザルと交差性のあるキットもあります。
◆FluoroSpotキットでは、最大4ターゲット検出のキットを用意しています。

製品ラインナップ

ダブルカラー発色ELISPOTキット、2カラー以上のFluoroSpotキットについては
マルチプレックスELISPOT/FluoroSpotキットのページをご覧ください。

シングルカラーELISPOT/FluoroSpot kit

　　　

T細胞発色/蛍光 シングルカラー	ヒト/Human	霊長類/NHP 種別交差表	マウス/Mouse	ラット/Rat	ブタ/Pig
IFN-γ	〇	〇	〇	〇	〇
New IFN-γ-Rapid >>製品詳細	〇(発色のみ）	〇(発色のみ）
IL-2	〇	〇	〇
IL-4	〇	〇	〇
IL-5	〇	△	〇
IL-6	〇	〇	〇
IL-10	〇	〇	〇
IL-12	〇	△
IL-13	〇	〇
IL-17	〇	〇	〇
IL-21	〇	×
IL-22	〇	×
TNF-α	〇	〇	〇
Granzyme B	〇	×
Perforin	〇	〇
GM-CSF	〇	〇

霊長類/NHPはヒト用キットとの交差性を確認したものです。【カニクイザル/Cynomolgus macaques、アカゲザル/Rhesus macaques、サバンナモンキー/African green monkey、ブタオザル/Pig-tailed Macaque】

キット構成

更新日（2025-02-18） 　　　　　　 　　　　　　 　　　　　　 　　　　　　 　　　　　　

構成品	内容	内容量
		2 Plateキット	5 Plateキット	10 Plateキット
PVDFメンブレンプレート	96wellホワイトプレートまたは8wellストリッププレート	2枚	5枚	10枚
CTL TEST Medium	無血清培地	100 mL　(CTLT-010)	100 mL (CTLT-010)×2本	500 mL (CTLT-005)
キャプチャー抗体	プレコートプレートの場合は添付無し 内容量はキットの種類によります	例）Human IFN-γの場合/ 1plate当たり40 μl使用
		90 μl	220 μl	440 μl
		例）Mouse IFN-γの場合/ 1plate当たり60 μl使用
		130 μl	320 μl	620 μl
検出用抗体	ビオチンラベル抗体 またはFITCラベル抗体 内容量はキットの種類によります	例）Human IFN-γの場合/ 1plate当たり40 μl使用
		90 μl	220 μl	440 μl
		例）Mouse IFN-γの場合/ 1plate当たり10 μl使用
		35 μl	70 μl	120 μl
抗体希釈液 A	Diluent A（キャプチャー抗体用） プレコートプレートの場合は添付無し	25 mL	55 mL	110 mL
抗体希釈液 B	Diluent B（検出抗体用）	25 mL	55 mL	110 mL
標識済みターシャリー	ストレプトアビジン-AP/ 1plate当たり10 μl使用 または抗FITC抗体-HRP、蛍光標識ストレプトアビジン、蛍光標識抗FITC抗体のいずれか	35 μl	65 μl	120 μl
ターシャリー希釈液	Diluent C	25 mL	55 mL	110 mL
発色基質（CTL-TruBlue）	(Blue substrate component 1)/ 1plate当たり160 μl使用	340 μl	850 μl	1.7 ml
	(Blue substrate component 2)/ 1plate当たり160 μl使用	340 μl	850 μl	1.7 ml
	(Blue substrate component 3)/ 1plate当たり92 μl使用	200 μl	500 μl	1 ml
プロトコール

推奨ポジティブコントロール

ヒトの抗原特異的T細胞モニタリングアッセイにおいて、CTL社ではT細胞と抗原提示細胞どちらも評価できるポジティブコントロールを推奨します。
マイトジェン刺激として知られるPMA/IonomycinやPHAは非特異的な非常に強い刺激であり、T細胞から強制的にサイトカインを放出させますが抗原特異的T細胞反応とは異なる応答となります。
また、Anti-CD3抗体はポリクローナルCD4+およびCD8+ T細胞刺激因子であり、汎用的に使用されていますが、通常のT細胞活性化経路とは異なります。
T細胞免疫モニタリングには、APCの機能を含むPBMCにおけるCD4+またはCD8+ T細胞検出のさまざまな要件を評価する生理学的T細胞活性化の試験に適した抗原が必要です。

※キットには含まれません。用途に合わせて別途ご用意ください。 　　　 　　　 　　　 　　　

【CD4活性化用タンパク質抗原ミックス】
推奨 CPI Positive control	幅広い人種由来の細胞について、抗原提示細胞（APC）による処理と抗原提示機能が不随する活性化を評価できます。 #CTL-CPI-001 CPI Positive control, 1.0 ml #CTL-CPI-005 CPI Positive control, 0.5 ml
【CD8活性化用タンパク質抗原ミックス】
推奨 CERI-MHC Class I Control Peptide Pool	従来のCEF ペプチドプールと比較して幅広いエピトープをカバーし、様々な人種由来の細胞から応答が得られます。 #CTL-CERI-300 CERI-MHC Class I Control Peptide Pool
CEF-MHC Class I Control Peptide Pool “Classic”	サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス由来のMHC Class I拘束性エピトープ23種のペプチドプールです。 #CTL-CEF-001 CEF Class I Control Peptide Pool "Classic" (23peptides)
CEF-MHC Class I Control Peptide Pool “Plus”	サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス由来のMHC Class I拘束性エピトープ32種のペプチドプールです。 CTL-CEF-002 CEF Class I Control Peptide Pool "Plus" (32peptides)

法規制等　【2025-01-10更新】

・カルタヘナ法はすべて非該当です。
・一部のキットに含まれていた劇物（チメロサール）の含有は無くなりました。（2025-01-10） 　 　 　 　 　

製品群	毒劇	化管法 (第1種指定）	化管法 (第2種指定)	労働安全衛生法	日本語SDS
発色シングルカラー Kit	-	-	-	該当 メタノール コンポーネント S3	SCE-SDS
蛍光シングルカラー Kit	-	-	-	-	-

型番からプレーコートの有無や動物種を知る方法については、FAQsをご覧ください。

関連製品

　　　　

ELISPOT解析受託サービス	ELISPOTアナライザー	B細胞ELISPOTキット	マルチプレックスELISPOT/FluoroSpotキット
ヒト末梢血単核球（PBMC)	抗原とポジティブコントロール	C.T.L社無血清培地と各種試薬	ELISPOTキット 製品検索

プロトコール

アプリケーションノート