NeStアプリケーションフライヤー（和文・PDF)

NeStアッセイ（Neuroaffinity and Stoichiometry）

タンパク質凝集体は、多量体、もつれ、まだら状、繊維状になったミスフォールドしたタンパク質の集合体です。アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)など広範囲の神経変性疾患は、毒性の凝集体の形成と蓄積、進行性の神経機能障害、そして細胞死を伴います。しかしながら、これらの凝集体の特徴、薬剤候補との相互作用の特徴を明らかにすることは困難を伴ってきました。病原性タンパク質の多量体や繊維状は、巨大で、不均一で、形態、サイズ、安定性が様々なので、試料の調製も測定も困難にしています。

こうした課題に対して、Fluidity One-Mがサポートします
Fluidity One-Mはお客様の課題を念頭に置いて開発されました。独自のマイクロ流体拡散サイジング（Micro Fluidic Diffusional Sizing：MDS)テクノロジーは、生体液から直接、免疫反応の包括的な特徴付けを可能にします。高度な機械学習による実験ガイダンスを備えたスマートアシスタントFluidity Insightは、常に正しい道筋で研究が進められることを保証します。

アプリケーションノート（英文・PDF） 神経毒性アミロイド種に対する抗体の親和性と結合化学量論の溶液中測定 このアプリケーションノートでは、MDS を利用して、抗体とアミロイドオリゴマーまたは線維によって形成されるタンパク質複合体のサイズ、親和性、化学量論を測定する方法を学びます。

タンパク質凝集体の特徴付けと相互作用を手間をかけずに解析

実際のサイズ
結合パートナーとの相互作用と複合体の形成、状態、安定性の理解に複合体のサイズを測定

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Huらは、マイクロ流体拡散サイズ法を用いて、ガングリオシド脂質粒子単独およびアミロイドβペプチド存在下でのサイズを測定することで、低µM濃度でもアミロイドペプチドが脂質粒子に結合することを実証した。本研究は、「アルツハイマー病の病態において重要な役割を果たしている可能性のある糖脂質-ペプチド相互作用に寄与した」。

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アルツハイマー病の病理に重要な相互作用、すなわち低μM濃度のアミロイドβペプチドとガングリオシド脂質粒子との直接的な相互作用がMDSで検出された

実際の環境
固定化不要な溶液中での測定。クルードな細胞破砕物、脳脊髄液のような本来の環境下での測定

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マイクロ流体拡散サイズ測定法は、生体液中のタンパク質相互作用を直接解析します。この例では、細胞溶解物中のシヌクレイン種への抗シヌクレインナノボディの結合を検出するために使用されました。本技術は、溶液中の対象粒子のサイズを測定できるため、無秩序なモノマー性α-シヌクレインへの結合と線維への結合を区別することが可能です。

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α-シヌクレイン特異的ナノボディがα-シヌクレインの存在とオリゴマー状態を、単純なバッファー系と細胞破砕物中の両方で検出できた

真の洞察
標準化されたモデルを利用し、モノマー、オリゴマー、フィブリルとの相互作用の化学量論を直感的に計算

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FDA承認のアルツハイマー病治療薬アデュカヌマブの作用機序が、マイクロ流体拡散サイズ測定法を用いて解明されました。本研究では、アデュカヌマブがアミロイドβ線維の側面を被覆し、自己増幅型の二次核形成過程を阻害することが明らかになりました。これまで効果がなかった治療候補薬であるバピネズマブとガンテネルマブは線維の末端に結合するのに対し、ソラネズマブは単量体アミロイドβを隔離することが分かりました。

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MDSを用いた化学量論測定（NeStアッセイ）によって、アデュカヌマブがアミロイドβフィブリルに高密度で結合して完全に覆い、二次核形成を阻害することを明らかにした

関連文献

抗Aβ抗体の作用機序を研究する
Linseらは、速度論的解析とMDS結合測定を組み合わせ、臨床段階にある4種類の抗Aβ抗体の作用機序を解明しました。彼らは、これらの抗体が凝集速度論およびオリゴマー凝集体の生成に及ぼす影響を定量化し、これらの影響を各抗体のAβモノマーおよび線維状形態に対する親和性および化学量論と関連付けました。その結果、4種類の抗体のうち1種類だけが、Aβオリゴマーのフラックスを劇的に減少させ、それが阻害能と関連していることが示されました。

Linse, Sara, et al. “Kinetic fingerprints differentiate the mechanisms of action of anti-Aβ antibodies.” Nature structural & molecular biology 27.12 (2020): 1125-1133.

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αSyn凝集アッセイにおけるαSyn-LiPの挙動を調査する
Falkeらは、パーキンソン病の病態に関与するα-シヌクレイン（αSyn）アミロイド線維の形成におけるα-シヌクレイン由来脂質粒子の役割を調査する方法の一つとしてMDSを用いた。この研究は、αSyn脂質粒子が、適用条件に応じてαSynの凝集を効果的に誘導、促進、または阻害できることを示唆した。

Falke, Marcel, et al. “α-Synuclein-derived lipoparticles in the study of α-Synuclein amyloid fibril formation.” Chemistry and physics of lipids 220 (2019): 57-65.