MAFFconアプリケーションフライヤー（和文・PDF)

膜タンパク質研究における課題

ヒト遺伝子の約3分の1は膜タンパク質をコードしており、その多様性と重要性を物語っています。膜タンパク質の変異は、心臓病、神経疾患、がん、嚢胞性線維症など、多くの一般的なヒト疾患の原因となるため、創薬開発において極めて重要な標的となっています。実際、現在の低分子医薬品の50%以上が膜タンパク質を標的としています。

膜タンパク質は広く普及し、その重要性も高いにもかかわらず、高解像度のタンパク質構造のうち1%未満しか占めていません。膜タンパク質の発現、精製、安定化は時間がかかり、困難です。また、たとえ実現できたとしても、多くの相互作用解析技術で必要とされる固定化によって貴重なタンパク質が損傷するリスクがあります。それゆえ、この多岐にわたる課題からは、膜タンパク質の構造安定性、フォールディング、オリゴマー化、結合、機能のすべてを、精製せずに研究することが可能かという疑問が生じます。

こうした課題に対して、Fluidity One-Mがサポートします
Fluidity One-Mはお客様の課題を念頭に置いて開発されました。独自のマイクロ流体拡散サイジング（Micro Fluidic Diffusional Sizing：MDS)テクノロジーとシングルユースのマイクロ流体チャンネルは、アーティファクトを除きつつ粗精製膜タンパク質の、溶液中測定を迅速かつ簡単に行えます。高度な機械学習による実験ガイダンスを備えたスマートアシスタントFluidity Insightは、常に正しい道筋で研究が進められることを保証します。

アプリケーションノート（英文・PDF） 精製不要な膜タンパク質の親和性および濃度測定 このアプリケーションノートでは、粗細胞膜から直接抽出した天然脂質二重層環境における膜タンパク質標的の濃度と特定のリガンドへの結合親和性の両方を同時に測定できるサンプル調製および分析方法を紹介します。

膜タンパク質とその相互作用を手間をかけずに解析

実際のサイズ
Glyco-DIBMAは脂質ベシクルを可溶化し、二重層構造を維持したまま、化学的タンパク質コンジュゲーション技術に適合する小型で安定したナノディスクを生成します。
本研究では、Glyco-DIBMAを用いて、Hisタグ付き電位依存性K+チャネルタンパク質KvAPを発現するE. coli膜を可溶化しました。得られたナノディスクはATTO-488で標識され、遊離色素とナノディスクに埋め込まれたATTO-488-KvAPのサイズは、マイクロ流体拡散サイジング法（MDS)を用いて測定されました。

詳しくは元の記事をご覧ください。

ナノディスク中の電位依存性K+チャンネルタンパク質KvAPが可溶化できたことが、MDSで測定されたKvAPナノディスクとDLSで決定された空のナノディスクのサイズと一致することから示された。(Danielczaketal.Nanoscale2022,1855)

実際の環境
膜タンパク質を扱う上で最も困難な要素の一つは、可溶化され、適切にフォールディングされたタンパク質を得ることです。全長タンパク質を直接取り扱い、界面活性剤の必要性を排除することで、膜タンパク質のワークフローは大幅に簡素化され、同時にアーティファクトの混入も防止できます。このアプリケーションノートでは、細胞膜全体をナノディスクに可溶化することで、結合研究に直接解析可能な粗膜タンパク質ライブラリを作製します。MDSを用いることで、ナノディスクに埋め込まれた膜タンパク質への標識抗体プローブの結合を測定できます。

ネイティブな膜タンパク質ナノディスクライブラリーの作成ワークフロー。蛍光標識したトラスツズマブの相互作用は特異的で、メラノーマ細胞由来のライブラリーでは著しく結合が低下し、空のナノディスクでは無視できるレベルまで低下した。

真の洞察
この例では、細胞膜標本中に存在する膜タンパク質HER2のコピー数を、標識されたターゲットの濃度を変えて滴定することで決定しました。この結果は、現在のがん細胞におけるHER2レベルの分類（陰性（0、1+）、陽性（3+）、不明（2+）という広範なカテゴリー）を大幅に改善するものです。

トラスツズマブとHER2発現細胞株からの膜タンパク質ライブラリーとの相互作用は、結合親和性が500 pM でHER2のコピー数は細胞１個当たり4×10⁶個であることを示した。

関連文献

混合脂質タンパク質粒子のサイズを決定する
膜タンパク質は環境に非常に敏感であるため、本来の脂質を界面活性剤に置き換えると、その構造と機能に悪影響を与える可能性があります。Danielczakらは、生体適合性の高い脂質ナノディスクを生成するための新しいポリマーを開発しました。この新しいポリマーを用いて形成されたナノディスクは、様々な合成脂質と一貫したサイズを示し、埋め込まれたタンパク質はin situで蛍光標識できるため、ナノディスクポリマーの一貫性と堅牢性が強調されます。

Danielczak, Bartholomäus, et al. “A bioinspired glycopolymer for capturing membrane proteins in native-like lipid-bilayer nanodiscs” Nanoscale 14 (2022): 1855-1867