BrightBox

製品仕様について

冷蔵品で製品が届きました。問題ないでしょうか?

本キットは冷凍便、冷蔵便どちらでも発送可能です。お受け取り後は2~8℃で保存してください。

キットは何℃で保存すればよいですか?

冷蔵で保存してください。

室温でどの程度安定ですか?

室温で1週間以上安定です。

アッセイミックスとスタンダードミックスを凍結しても大丈夫ですか?

凍結融解はある程度可能ですが、繰り返しはなるべくお避け下さい。

本製品のダイナミックレンジを教えて下さい。

キットに含まれるスタンダードのダイナミックレンジは2-30nMですが、1nMから50nMまで正確に反応します。この値はサンプル1uLの使用を想定しており、サンプル2uLを使用する場合、ライブラリのダイナミックレンジは1-15nMとなります。

使用できないサンプルバッファーはありますか?

一般的な溶出バッファーはアッセイに影響しませんでした。
低濃度のTE、0.1%のTweenでサンプル量5uLまでテストしていますが、阻害効果はありませんでした。

キットの原理について教えてください。

本キットは、様々な酵素とオリゴヌクレオチドを用いて蛍光シグナルを発生させます。断片のサイズに関係なく、ライブラリー1分子あたり同量の蛍光を発生させます。

なぜサーマルサイクルにかける必要があるのですか?PCR増幅をしているのでしょうか?

温度サイクルは蛍光シグナルを直線的に増幅させますが、ライブラリー分子は増幅されません。

この製品は、ライブラリー断片とアダプターダイマーを区別していますか?

BrightBoxアッセイは、P5とP7が存在するフラグメントをすべて検出し、アダプターダイマーにはこれらの両方を含むため区別されません。
qPCRによる従来の方法でも、アダプターダイマーは検出されます。qPCRの場合は、BrightBoxとは異なり、短いフラグメントの増幅が優先されるため、結果はアダプターダイマーの影響を大きく受けます。

アダプターダイマーの量を正確に判断するには、フラグメント解析を行うことが必要です。許容できないレベルのアダプターダイマーがある場合は、ライブラリーを再精製することが最も正確な方法です。

アッセイ手順

スタンダード溶液はどのように混合すればよいですか?

チューブを激しくボルテックスしてください。

アッセイミックスはどのように混ぜるのですか?

アッセイミックスには酵素が含まれていますので、ボルテックスしないでください。チューブを静かに反転させて混和してください。

サンプル調製中のチューブは氷上に置く必要がありますか?

いいえ、室温で行ってください。

実験台に置くときに遮光をした方がよいでしょうか?

長時間置く場合は、アッセイミックスを光にさらすことは避けて下さい。

混合した反応液は、どのくらい保管できますか?

遮光、室温で24時間以上安定です。

なぜ反応前の測定が必要なのですか?

これは、ウェル間のばらつきを低減するもので、最初の数サイクルのPCRで各ウェルの「ベースライン」蛍光を設定する、PCR中に行われるものと同様です。

はじめてBrightBoxアッセイを行う場合、どのように進めていけばよいでしょうか?

推奨される段階的なテスト方法は以下の通りです。
・プロトコールに記載された設定をqPCR装置に入力し、10サイクルでプログラムします。
・装置のプログラムをチェックするために、適当なプレート(空のプレートでも可)をセットし、Runを実行します。
・アッセイ手順に慣れる、装置が正しく動作している、正しいデータがエクスポートされている、ことを確認するために、スタンダードだけを使用してアッセイします。
・最後に、スタンダードと8 または 16種類の自分のライブラリを使用してRunを実行してキットに慣れるようにします。必要に応じてサイクル数を減らしてください。

ラボのqPCR装置は、読み取りステップに10秒以上必要ですが、どうしたらいいですか?

この時間は必須ではありませんので、増やすことができます。装置によっては、最低19秒のステップを必要とするものもあります。

レプリカは何種類必要ですか?

3種類、Technical Triplicates(テクニカルトリプレット)でご用意ください。生物学的複製は必要ありません。

解析について

テクニカルレプリケートのうち、1つの値が他の2つとずれています。この値はどのように扱えば良いでしょうか?

一部のウェルでは、バックグラウンドの蛍光が高くなり、このような現象が起こる可能性があるため、そのようなウェルの値は削除してください。

スタンダード2nMの値が非常に低く、バックグラウンドに近いのですが、どうしたらよいでしょうか?

感度が低い装置ではこのようなことが起こりえます。サイクル数を増やして、蛍光量をリニアに増やしてください。

データ解析はどのように行うのですか?

こちらのスプレッドシートをご使用下さい。以下に、YouTubeのビデオをご用意しています。一連の動画は 装置のプログラミングやデータ解析について、様々な種類の装置を使用して説明するために作成されました。
• QuantStudio 3, 5, 6Pro and 7Pro: programming and data analysis:
https://www.youtube.com/watch?v=pfOfLzf4slc&t=4s

• LC 480: programming and data analysis:
https://www.youtube.com/watch?v=OinPdue_eyc&t=7s

• StepOnePlus: programming and data analysis:
https://www.youtube.com/watch?v=hSMqTC-8L_g&t=24s

• StepOnePlus: Data analysis using a customized worksheet
 https://www.youtube.com/watch?v=HtpLO-sK-jw

• Agilent AriaMX: programming and data analysis:
https://www.youtube.com/watch?v=nLro9kQchtI&t=4s

• Bio-Rad CFX: programming and data analysis:
 https://www.youtube.com/watch?v=ryT8JhnwAv0

• QuantStudio 6 and 7 Flex: programming and data analysis:
https://www.youtube.com/watch?v=aCxRJhrQQHU
• Data analysis only:
https://www.youtube.com/watch?v=Qd0ylCU_dcw&t=12s

低濃度の値の一部がマイナスになっているのはなぜですか?

マイナスの値が出ることはあります。 アッセイで蛍光を発生させる方法と使用する装置により、反応前の読み取り値の蛍光が反応後の読み取り値より高くなることがあり、その結果負の値になることがあります。これは単なる引き算であり、すべての反応で同じ量(各反応のボリュームに対して)が差し引かれるため、問題ありません。
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