客観的、科学的に検証されたELISPOT計数ソフトウェア ImmunoSpot® Software
ImmunoSpot® Software Suiteのスポットカウンティング精度は、厳密な実験的検証に基づいています。
このソフトウェアは、25年にわたるELISPOTの科学的専門知識の蓄積に基づき、シンプルな自動計数アルゴリズムを実装しています。 エキスパートモードでは、ユーザーがあらゆる計数パラメーターを変更し、スポットサイズやスポット形態に基づいてハイコンテンツ解析を実行することができます。
内蔵のユーザー認証、監査証跡、データセキュリティにより、規制環境下での透明性の高い ELISPOT カウンティングをサポートします。
このソフトウェアは、25年にわたるELISPOTの科学的専門知識の蓄積に基づき、シンプルな自動計数アルゴリズムを実装しています。 エキスパートモードでは、ユーザーがあらゆる計数パラメーターを変更し、スポットサイズやスポット形態に基づいてハイコンテンツ解析を実行することができます。
内蔵のユーザー認証、監査証跡、データセキュリティにより、規制環境下での透明性の高い ELISPOT カウンティングをサポートします。
客観的、科学的に検証されたELISPOT計数法
抗原特異的T細胞一つ一つのサイトカインフットプリント、およびその結果得られるELISPOTは、サイズおよび強度ともに著しく多様なスポット示します[ref]。このように発生するスポットサイズの範囲が広いため、単一の抗原刺激T細胞から発生する真のシグナル（スポット）と、バックグラウンドノイズ（自然免疫系の細胞から分泌される分析物）または隣接する細胞のクラスター由来のスポットを区別することは困難です。
ここでは、客観的で科学的に検証されたELISPOTカウンティングを可能にするImmunoSpot®ソフトウェアの基本原理のキーとなる主要な文献を例に挙げながらその詳細をご説明します。
（図1）T細胞ELISPOTの結果（IFN-γアッセイ）の解析にスポットサイズゲーティングを適用した例。画像をクリックすると拡大されます。
上段（a）
あるドナー由来PBMCのELISPOTウェル画像。左側には培地（ネガティブ）コントロールのウェル、右側には抗原で刺激されたウェルが示されている。このドナーでは、臨床サンプルでよく見られるように、サイトカインストームが発生し、中程度の高いIFN-γバックグラウンドが見られた。活性化されたマクロファージやNK細胞自然免疫系の細胞によって生成されるこのようなバックグラウンドスポットは、T細胞によって生成される抗原誘発スポットに比べて一般的に小さいことが知られている。
中段(b)
バックグラウンドスポットと抗原誘発スポットを区別せず、すべてのスポットを数えており意味を持たないカウント数。
下段（c）
ImmunoSpot® ソフトウェアの自動化アルゴリズムにより、適切なゲーティングを行った後のカウントとカウントされたスポットのオーバーレイ（赤い輪郭）を示している。バックグラウンドスポットのスポットサイズ/密度分布は左のヒストグラムを参照し、これを抗原トリガーウェルのスポットサイズ/密度分布のヒストグラムと比較している（ヒストグラム参照）。バックグラウンド分布を超えるスポットのサイズ/密度分布は、自動統計解析により、対数正規分布と仮定し、AutoGate™機能によりカウントの上限ゲートと下限ゲートが自動的に設定される。
CTLの科学者は、Paul V. Lehmann教授の指揮の下、ELISPOT研究の分野で200以上の論文を発表しており（参照）、特に抗原特異的T細胞ELISPOTアッセイの正確な自動計数のルールを確立することに貢献しています。
以下では、 AutoGate™機能が客観的かつ科学的に検証された方法で行えることを示唆する科学的根拠を説明します。
クローン化した個々のT細胞のELISPOTシグネチャー
CTLの最初の取り組みは、定義されたT細胞集団、すなわちT細胞クローンの分泌シグネチャーの研究に焦点を当てたものでした。このような研究により、検出されるスポットのサイズと強度の両方において広いダイナミックレンジが明らかになり、[ref]そこで完璧に近い対数正規サイズ分布に従うことが判明しました。（文献から抜粋した図2を参照）重要なことは、ウェルに播種されたすべてのT細胞を検出するためには、ウェルごとに全範囲のスポットサイズを数える必要があることです。
(図２)T細胞クローンの分泌シグネチャーから、ELISPOTのサイズ分布が対数正規分布であることがわかる。抗原提示細胞（APC）のクローン集団上で活性化される均一な特異性を持つT細胞でさえ、単一濃度のペプチド抗原では、このように幅広いスポットサイズが生成され、しかし集団としては対数正規分布に従います。
ex vivoで分離された初代T細胞のELISPOTシグネチャー
後続の研究では、通常のELISPOTアッセイで見られるようなT細胞からのサイトカインのシグネチャーという、あまり定義されていない、より関連性の高いシナリオに注目し、フレッシュな細胞を対象に研究を行いました。CTLは、T細胞のELISIPOTアッセイにおいて対数正規サイズ分布がルールであるかどうかを検証するために、系統的な研究を行いました[ref]。CTLは、CD8細胞リコールのために定義されたHLA Class I収束エピトープを表す32個のウイルスペプチドと、CD4細胞活性化のためにCMVとEBVのタンパク質抗原で刺激した後の172人の健康人ドナーのPBMCを用いてELISPOTアッセイのIFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5 とIL-17スポットのスポット形状を調べました。合計414のT細胞リコール反応が解析され、これらのケースの99.7%において、スポットサイズは対数正規分布に従っており、ヒトT細胞ELISPOTアッセイ分析における一般的なルールとして対数正規サイズ分布が確固として確立されました。
統計学に基づく客観的ELISPOT計数
上記の研究により、T細胞ELISPOTアッセイにおける原則として対数正規スポットサイズ分布が確立され、客観的ELISPOTカウントのための古典的パラメトリック統計の適用が可能となりました[ref]。あるT細胞集団のスポットサイズ（対数スケール）が正規分布である場合、平均値から 3SD 以内の各スポットは 99.73% の確率で個々の抗原特異的 T 細胞に由来し、そのようにカウントされるべきということになります。あるアッセイの平均スポットサイズより3SD低いスポットは、99.73%の確率でT細胞以外のバイスタンダーサイトカイン分泌、またはアーチファクトによるもので、ImmunoSpot® AutoGate™機能使用時と同様にカウントから除外する必要があります。最大サイズゲート以上のスポット（平均スポットサイズより3SD以上大きい）は、個々のT細胞によるものではなく、むしろ細胞クラスターによるものであるためそのように定義してカウントされるべきです。この場合、ImmunoSpot®ソフトウェアは、大きなクラスターを形成するために必要な平均サイズの個別スポットの数を自動的に推定し、算出された数をそのウェルのカウントに含めます。ImmunoSpot® は、培地バックグラウンド（ネガティブコントロール）と抗原テストウェルの両方について、ユーザー入力と機械学習ツールにより、最小および最大サイズのゲートを決定するための統計解析を行い、スポットサイズ分布を自動的に確立します。このように、ImmunoSpot®は、ELISPOTアッセイの客観的でユーザーに依存しない分析を提供します。
ユーザーおよびアナライザーに依存しないT細胞ELISPOTカウントの再現性
9つの独立した研究室に、全く同じELISPOTプレートを順番に渡したところ、ウェル間のスポットカウントに大きな範囲とばらつきがあることが判明しました。これらのラボは、画像取得に独自のImmunoSpot®リーダー（異なるモデルを含む）を使用しましたが、SmartCount™機能（カウントパラメータの客観的設定にSmartSpot®、客観的ゲーティングにSmartGate™を含む）に依存した場合、すべて基本的に同一のカウントを得ることができました[ref]。専門家による主観的な計数パラメーターの手動設定の方が、最適な計数には適していると考える人のために、上記の文献の図を図3として掲載します。その中で、9つの研究所のそれぞれのELISPOT専門家は、プレートを再カウントするように求められたが、機械で生成されたカウントの精度を改善する試みで、カウントパラメータを手動で調整することであった。当然のことながら、これらの主観的な計数結果は、研究室間でかなりのばらつきを示しましたが、9つの主観的カウントの平均値は、ImmunoSpot®ソフトウェアが生成した結果と正確に一致しました。つまり、SmartCount™機能は専門家が主観的に設定したカウントのコンセンサスに対応したものであることがわかりました。
