概要

DebrisIndex™は、生産工程をモニターするためのツールで、細胞濃度に対する培養液中のデブリの量を読み取ることができます。このツールは、NucleoCounter^® NC-202™と付属のNC-View™ソフトウェアの機能です。
DebrisIndex™は、"細胞培養をいつ生産工程の次のステップに進めるか？"という重要な決定を行うためのプロセス・パラメーターとして活用することが可能で、この機能により、NucleoCounter^® NC-202™は細胞濃度、生細胞、死細胞の測定値とともに、バイオリアクターの細胞培養の適性を示すことが出来ます。

DebrisIndex™ のしくみ

既存の方法との比較

従来の自動セルカウンターでは、生細胞とアポトーシス小体や脱核細胞などの非生細胞物質を容易に区別することができません。このような細胞は、形態的に無傷の細胞に似ているため、トータル細胞数にカウントされ、結果として細胞の総数を多めに見積もってしまうことが起こりえます。

DebrisIndex™の原理

DebrisIndex™は、強力な細胞染色であるアクリジンオレンジ（AO）と4′，6-ジアミノ-2-フェニルインドール（DAPI）を使用し、それぞれ細胞物質と死んだ細胞の核を染色します。NucleoCounter^® NC-202™ と NC-View™ ソフトウェアは、生細胞、死細胞、デブリの3種類の蛍光強度を記録し解析します。

生細胞、死細胞、細胞デブリ

図に例として示すように、細胞培養において、全部で9個の細胞があると仮定します。細胞計数の方法によっては、これらの細胞は4つの生存細胞（黄色の核で示される）と2つの死細胞として解析される可能性があります。あるソフトウェアのアルゴリズムでは、同じサンプルを分析し、5つの死細胞（灰色の核とすべての不規則な形の細胞を認識）と結果を表示します。デブリを死細胞である誤認すると、細胞培養の生存率が低くても、細胞数が増加することになります。

NucleoCounter^®NC-202™は、死細胞1個（灰色の核を持つ丸い形の細胞として表示）とデブリ4個（不規則な形の細胞）を記録し、DebrisIndex™は80(（細胞デブリイベント / 全細胞数) ×100）となり、生細胞以外の細胞やデブリの解析によって詳細な結果を得ることができます。

結論として、生細胞と死細胞は、NucleoCounter^®NC-202™によって、a) 無傷の生細胞核、b) 死細胞核、c) デブリ（細胞に似ている細胞核に損傷があるもの）としてより正確に定義することができます。

DebrisIndex™を生産工程で使用する

アポトーシス小体やその他の細胞様の断片を死細胞と区別することにより、信頼性の高い結果を得ることができます。DebrisIndex™ は、細胞培養の全体的な適正とパフォーマンスを読み取ることができます。したがって、生産プロセスにおいて細胞培養を次のステップに進めるための追加的なプロセスパラメーターとして、DebrisIndex™ を活用することができます。

DebrisIndex™データ

HEK293細胞の飢餓培養

死細胞数の増加およびDebrisIndex™データは、生細胞数の減少と相関しています。これは、細胞培養の成長が最大に達し、栄養競合と細胞の残骸がさらなる細胞成長を阻害していることを示します。

この図は、HEK293F細胞株を飢餓条件下で18日間連続培養した際の生細胞数、死細胞数、DebrisIndex™データの推移を示したものです。

CHO細胞のバイオリアクター培養

DebrisIndex™ は、高生存率の細胞培養にも適用できます。CHO細胞の培養密度は、培養開始から8日後に定常状態に達するまで成長します。死細胞数は培養期間中ゆっくりと増加しますが、良好な培養条件によって低水準に保たれます。DebrisIndex™データは12日目まで検出されませんが、それから死細胞数はゆっくりと上昇し、細胞密度が最大容量に達したところで細胞が破壊され始めたことを、デブリの出現によって知ることが出来ます。

図は、バイオリアクターでの14日間培養（フェッドバッチ培養）におけるCHO細胞株の生細胞数、死細胞数、DebrisIndex™データの推移を示したものです。

細胞培養における酵母汚染検出

細胞培養の成長パターンが明確であれば、DebrisIndex™は酵母の混入を検出するために使用できます。標準的な生産工程においてDebrisIndex™の異常なタイミングでの大きな変動があった場合、デブリが不規則に蓄積していることを示し、これは細胞培養の汚染に由来する可能性があり、さらなる調査を進めることが可能です。